此次分享的文章发表在Circulation上，影响因子18.88。
（小编友情提示，文章较长，耐心阅读，您一定有所收获）
研究目的和意义：心血管疾病是全球死亡的主要原因之一，其中动脉粥样硬化病变是导致心肌梗塞、中风和周围血管病变的罪魁祸首。虽然局部病变可以通过手术治疗的手段治愈，但这些手术可能会因为病变造成的内膜增生而变得复杂。血管平滑肌细胞（SMC）可以合成细胞外基质（ECM），对于组织重塑具有重要作用，SMC增殖是对血管损伤的早期反应，但随着时间的推移，由于ECM的沉积，损伤部位会继续生长，其中包括胶原和纤维连接蛋白增多。由于该基质可占病变体积的80%，所以研究潜在的SMC-ECM合成仍然是一个重要问题。
转化生长因子-β（TGF-β）是许多组织中血管损伤和诱导纤维化、导致ECM过度沉积的一个中心调节因子，通过典型和非典型途径诱导下游信号转导。LIM结构域7（LMO7）定位于质膜、细胞骨架和细胞核内，已被证明在粘附连接、细胞迁移和基因转录中发挥重要作用。有科学家研究发现在肝癌细胞中，LMO7是TGF-β的靶基因，但其在血管生理学和纤维化中的作用尚不清楚。所以结合以上的研究基础，作者着重研究了其对内膜增生、伤口愈合和纤维化疾病的影响。
RESULTS
一、血管平滑肌细胞中LMO7缺失会加剧内膜增生和ECM沉积
对野生型（WT）小鼠进行颈动脉结扎术，在3-28天的时间点采集损伤的血管。免疫荧光染色显示，未受损血管中的LMO7表达水平较低，在损伤后第7天被高度诱导，在第10天达到峰值，但在28天内仍然升高。并且可以通过p-Smad3染色所示,随着时间的推移,TGF-β1信号通路在血管损伤中逐渐增强，并通过SMC增殖和ECM合成导致内膜增生。
接下来，研究人员研究的是在血管平滑肌细胞(SMC）中，LMO7是否是TGF-β1的靶基因。以浓度和时间依赖性的方式用TGF-β1处理人冠状动脉SMC，LMO7的mRNA和蛋白表达增加，48小时TGF-β1处理浓度为0.5ng/ml时，LMO7蛋白表达水平达到峰值。
为了研究LMO7在血管损伤中的作用，对LMO7基因缺失（LMO7-/-）的小鼠进行颈动脉结扎或股动脉剥脱。EVG染色显示，尽管在LMO7+/+和LMO7-/-小鼠之间未受损血管没有明显的形态差异，但在两种小鼠的损伤血管模型中，LMO7-/-小鼠的新生内膜扩张程度是LMO7+/+小鼠的两倍多。
由于SMC在内膜增生中起着核心作用，将LMO7fl/fl与LMO7iΔSM（原文是crossingLMO7fl/flwithMyh11_creERT2(LMO7ΔSM)不明白这两种小鼠种系，求解答）杂交得到LMO7敲除小鼠，用来研究血管平滑肌细胞的特异性。
以三苯氧胺处理的LMO7+/+/Myh11_creERT2为对照组的小鼠。在两种损伤模型中，LMO7iΔSM小鼠表现出比对照组更严重的内膜扩张，其程度与基因敲除的小鼠相似，说明SMC中的LMO7损失促进了新生内膜的形成。
在LMO7-/-小鼠中，Ki67免疫组化显示颈动脉结扎后28天或股动脉内皮细胞剥蚀损伤10天后，内膜增生增强。
与对照组相比，敲除LMO7的小鼠主动脉的SMC或人CASMC也表现出细胞数目的增加和增殖。
尽管LMO7iΔsm和对照组小鼠的未损伤血管ECM沉积没有明显差异，但Masson三色染色和PSR染色显示，LMO7iΔsm组损伤的血管内侧和内膜层的胶原增加明显。
LMO7-/-小鼠主动脉中主要的ECM标志基因col1a1、col1a2、col3a1和fn1的表达较高，比WT-SMC高10倍。TGF-β1处理后，LMO7-/-细胞中的ECM基因总水平表达更高，达到WT基线水平的25倍。
对于颈动脉结扎损伤，LMO7iΔsm组与对照组相比，LMO7iΔsm组新生内膜大小增加3.76±3.10倍，对照组增加2.16±1.15倍。同样，在股骨剥皮模型中，内膜细胞数增加1.42±0.41倍，内膜大小增加了1.92±0.97倍。
这些数据集中在一起提示LMO7在SMC中是由TGF-β1诱导，并且LMO7缺乏导致过度增殖和增强的细胞外基质沉积，这两者都导致了血管损伤后ECM过度增殖和新生内膜的形成。
二、在缺乏LMO7的SMC中，TGF-β信号和ECM基因表达增加
考虑到缺乏LMO7的损伤的血管表现出过度的内膜增生和ECM沉积，并且LMO7本身是一个TGF-β1-靶基因，研究人员预测LMO7可能作为TGF-β信号一个负反馈调节因子，限制损伤反应。为了验证这一假设，研究人员用Smad3磷酸化（p-Smad3）作为损伤后TGF-β活性的指标。损伤后第28天，LMO7iΔsm组血管新生内膜的p-Smad3免疫荧光染色比对照组强，表明TGF-β活性增加。在LMO7iΔsm组小鼠中，损伤后第28天，ACTA2水平升高，也与TGF-β信号的升高一致。
TGF-β或其效应物CTGF的免疫荧光染色也显示损伤后第28天，LMO7iΔSM组血管中TGF-β活性增强。
在LMO7iΔSM组小鼠和LMO7-/-组小鼠股动脉损伤下，TGF-β信号也增强。重要的是，与对照组小鼠相比，LMO7iΔSM小鼠颈动脉结扎损伤后3-28天的所有时间点的TGF-β和CTGF增加。
在对照组小鼠中，CTGF在第14天达到峰值，然后下降。在LMO7iΔsm小鼠中却没有这样的下降趋势，这表明LMO7的丢失会导致TGF-β信号的增加，而且更持久。而且与这些发现一致的是，TGF-β1在LMO7-/-小鼠的SMC中诱导了更高水平的p-Smad3，其在0.5ng/mlTGF-β1时显著，所以在整个研究中使用的剂量。
为了确定增强的TGF-β信号是否与LMO7-/-小鼠的新生内膜和ECM沉积增加有关，研究人员通过每日注射TGF-β-R1抑制剂SB来阻断这一信号。p-Smad3染色减少证实抑制了TGF-β信号转导。注射TGF-β受体抑制剂可阻止对照组小鼠新生内膜的形成，并显著降低LMO7-/-小鼠新生内膜和胶原染色。同样，使用SB治疗可将LMO7-/-小鼠SMC中TGF-β诱导的ECM基因降低到低于对照组基线水平。
三、LMO7缺失导致TGF-β1和αvβ3整合素表达升高
为了了解LMO7的缺失如何增强TGF-β的作用，研究人员检测了对照组和LMO7缺陷小鼠组中的TGFβ1mRNA和激活蛋白的表达。
在LMO7-/-小鼠未损伤的主动脉中检测到TGFB1mRNA水平高于对照组。LMO7-/-小鼠SMC中TGFB1mRNA的表达水平也高于对照组。已知TGF-β1以正反馈调节的形式转录诱导其自身表达，与对照组相比，这种自身诱导会使LMO7-/-SMC中TGFB1表达更高水平。这些mRNA的增加也反映在蛋白质水平上，与对照组相比，在LMO7-/-SMC中，TGF-β1总分泌是对照组的两倍。
在培养基中添加TGF-β中和抗体可将LMO7-/-细胞中的ECM基因表达升高降低到野生型基线水平。
亨德森等人最近的一项研究揭示αv整合素作为一个关键调节因子激活潜伏性tgf-β和组织多器官的纤维化。在损伤的血管中αv和β3亚单位的免疫染色显示，与对照组相比，LMO7iΔsm小鼠的表达增强。
LMO7-/-小鼠未损伤的主动脉中间层也检测出增加的αv和β3mRNA表达，而LMO7-/-小鼠的SMCs中αv和β3的表达水平高于对照组。用TGF-β1处理对照细胞诱导αv和β3的mRNA表达，其水平为在LMO7-/-ASMC中大大增加。
为了研究αvβ3整合素在LMO7-/-表型中的作用，研究人员用αvβ3整合素抑制剂西仑吉特cilengitide处理小鼠ASMCs。Western-blot和qPCR分析表明，西林吉特抑制了LMO7-/-SMCs中Smad3磷酸化的增加和ECM基因的增强表达。西林吉特还抑制了LMO7-/-SMCs中TGFB1的表达增加。这些数据表明，可能通过激活TGF-β，增强αvβ3在LMO7-/-SMC中的表达，从而上调下游Smad3信号传导和增加ECM靶基因表达。
四、LMO7抑制AP-1活性和TGF-β1自身诱导
研究数据表明，LMO7通过减少TGF-β的表达和整合素介导的活化来抑制TGF-β信号传导。接下来研究了LMO7调控TGF-β1和αVβ3整合素表达的分子机制。TGF-β1的自身诱导是通过AP-1（由UN,FOS和ATF家族组成的异源二聚体）介导的。由于TGF-β1和AP-1形成了增强TGF-β1信号的正反馈回路，所以研究人员猜测LMO7是否会调节AP-1活性。
qPCR结果表明，与对照组相比，LMO7-/-小鼠主动脉内层的AP-1亚单位jun和fos的mRNA水平显著升高。与WT相比，LMO7-/-小鼠SMC中jun和fos的表达也升高，用TGF-β1处理进一步诱导了它们在对照细胞和LMO7-/-SMC中的表达。人casmcs中敲除LMO7后，c-jun、c-fos、p-Smad3和β3整合素的表达增加。
为了确定AP-1是否在LMO7-/-SMC中增强TGF-β信号转导中起到作用，研究人员使用了小分子t，一种针对c-fos/ap-1的碱性区/亮氨酸拉链域的特异性抑制剂。与颈动脉结扎术后的治疗对照组相比，体内给予t可抑制LMO7-/-小鼠体内增强的ECM沉积和新生内膜形成，伴随着LMO7-/-组损伤的颈动脉p-Smad3染色降低。细胞实验证实t处理也抑制了LMO7-/-SMCs中的Smad3磷酸化。
此外，通过t治疗，相对于对照组SMC，包括Tgfb1,Itgav和Itgb3，LMO7-/-中的表达降低到野生型水平或更低。由于AP-1因子也经历了转录自身诱导，研究人员同样注意到在LMO7-/-细胞中AP-1依赖性调节Fos和Jun。t也抑制了LMO7-/-组SMC分泌TGF-β1。由于AP-1能积极调节SMC的增殖，因此LMO7-/-细胞的增殖增强也可能归因于诱导的AP-1表达。
五、LMO7通过介导其泛素化和蛋白酶体降解来抑制c-FOS和c-JUN
研究人员猜测LMO7是否调节AP-1蛋白的稳定性。AP-1蛋白的短半衰期从c-fos的约15分钟和c-jun的约45分钟分别延长到LMO7-/-SMC的60和90分钟。
在人CASMC中研究人员通过免疫共沉淀研究LMO7与c-FOS和c-FOS之间的作用关系。尽管对照组与siLMO7-HCASMC相比，c-fos或c-jun免疫沉淀存在些许差异，但26s蛋白酶体抑制剂MG处理后，对照组细胞的免疫沉淀中存在明显的泛素化，这表明LMO7促进泛素化和c-fos和c-jun的降解。
研究人员为了证明LIM结构域介导LMO7和AP-1组分之间相互作用的假设，切掉编码Lim结构域（LMO7Δc）的c端。在HEKA细胞中，全长（fl）LMO7而不是LMO7Δc与c-fos或c-jun共免疫沉淀。功能上，全长（fl）LMO7抑制了jun、fos、tgfb1及整合素和ECM基因mRNAs的表达。
同样，LMO7-/-SMC中全长（fl）LMO7的过表达可以抑制c-FOS，c-JUN、整合素β3蛋白表达和SMAD3磷酸化，而在LMO7ΔC中没有这样的实验结果。这些数据共同表明，与c-fos和c-jun的相互作用和降解需要LMO7的c端LIM区域。
六、在人内膜增生中，LMO7的表达与p-Smad3呈负相关
为了确定上述实验中，在小鼠血管损伤模型中观察到的LMO7的作用是否会运用到临床，转化为人类血管疾病，研究人员在心脏移植血管病变（CAV）患者冠状动脉和动静脉瘘患者的静脉LMO7和p-Smad3染色水平，两者都以与TGF-β升高相关的新内膜增生为特征。
对少量罕见人体样本的初步分析表明，正常对照血管中的LMO7水平较低，但疾病样本中的LMO7水平有所增加。此外，当以每个细胞为基础定量时，在CAV患者样本中的区域新生内膜中检测到LMO7和p-Smad3表达之间的负相关，在AVF样本中有这种趋势，这与在小鼠损伤诱导的内膜增生中的发现一致。
文章解读、基金设计，扫我吧
预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇